ACS-IRAP, regenerativna medicina i praktična veterinarska medicina

Kao što smo rekli, regenerativna medicina ima mnogo aspekata iako se najčešće misli na matične ćelije. U ovom članku ćemo govoriti o ACS-IRAP ili autologni konidicionirani serum – interleukin receptor antagonist protein. Šta se zapravo krije iza ovako robustnog imena? U pitanju je serum koji se dobija iz krvi životinje koja će se lečiti. Zato se zove autologni, a kondicioniran znači da tako uzeta krv od pacijenta prolazi kroz određene faze pripreme (kondicioniranja), pre nego što se upotrebi za terapiju. IRAP označava protein koji se dobija takvim kondicioniranjem, koji je zapravo lek koji poseduje svaki organizam, samo mu malo treba ‘pomoći’ kako bi se IRAP sintetisao u većoj količini. Šta sve lečimo IRAP-om? Najpre inflmacije zglobova, povezano sa osteoartritisom (OA), gde postoji začarani krug njegove degeneracije i inflamacije, ali i neka druga patološka stanja.
Zapravo se ne zna egzaktno kako nastaje OA. Zna se da počinje degenerativnim neinflamatronim promenama, ali se na kraju završi inflamacijom. Uzroci nastanka degenerativnih promena u zglobu mogu biti razni, ali se najčešće navode mehanički faktori (što bi u tom slučaju mogao da bude i 'zamor materijala' nastao usled starosti životinje (ili čoveka), neadekvatnog treninga kada govorimo o sportskim konjima, razne stečene ili razvojne anomalije skeleta koje dovode do neregularnih statičkih i dinamičkih odnosa u zglobu, povreda tetiva i ligamenata koje dovode do nestabilnosti zglbova, itd..).

Dva začarana kruga: degenerativni i inflamatorni

Degenerativni procesi počinju promenjenim metabolizmom ćelija sinovijalne membrane, posebno u sinovijalnim recesusima, gde se obavlja sinteza hijaluronske kiseline (HA) najvećim delom. Smanjena sinteza HA i njeni kratki polimeri (molekulske težine manje od jednog miliona Daltona) dovode do smanjenog viskoziteta (gustine) sinovijalne tečnosti što rezultuje smanjenom lubrikacijom ('podmazivanjem') zgloba. Smanjeno podmazivanje dovodi do povećanog biomehaničkog stresa na zglobnu hrskavicu, te dolazi do njenog 'trošenja' – stvaranja mikrofisura i odvajanja mikrofragmenata sa njene površine. Ti mikrofragmenti dolaze u dodir sa sinovijalnom membranom, koja je vrlo reaktivna i prepoznaje ih kao strana tela odnosno antigene, reaguje infalamacijom i aktivacijom ćelija unutar nje. Tako nastaje sinovitis, odnosno počinje inflamatorni začarani krug.

Sinovitis zapravo znači da problemi sa obolelim zglobom postaju 'vidljivi'

Dolazi do aktivacije makofaga koje se nalaze u sinovijalnoj membrani, koje tada sintetišu IL1 glavni proinflamatorni citokin koji izaziva celu kaskadu reakcija kako unutar sinovijalne mebrane tako i unutar zglobnog prostora, tačnije zglobne hrskavice. IL1je peptid vrlo male molekulske težine iz familije glikoproteina koji se sintetiše i luči u neaktivnoj formi zvanoj proIL1. IL1 se vezuje za receptore na površini fibroblasta sinovijalne membrane i hondrocita hrskavice, koji bivaju podstaknuti da sintetišu inflamogene i proteolitičke enzime, u prvom redu matriks metaloproteinazu (MMP), agrekanazu, prostaglandin grupe E2, ali i druge citokine koji privlače leukocite u inflamirano područije. Dolazi do destrukcije tkiva i degradacije zglobne hrskavice, i otprilike tu se začarani krug zatvara, a svaki sledeći donosi i jaču infalmaciju zgloba. ACS-IRAP omogućava da krug ne bude zatvoren, već da se inflamacija polako smiri.
Pokušalo se sa raznim terapeutskim tretmanima, kako kod životinja tako i kod ljudi. Osnovni cilj je smanjenje količine IL1 u zglobu, odnosno sinovijalnoj tečnosti. Genska terapija je dala zadovoljavajuće rezultate, ali je bilo pratećih nepožaljnih efekata. Naime, pokušalo se sa adenovirusnim vektorom, koji bi isporučio hondrocitima i fibroblastima gen koji bi bio zadužen za sintezu interleukin receptor antagonista (IRAP). Nesumnjivo je utvrđeno da je došlo do značajnog povećanja količine IRAP u sinovijalnoj tečnosti, što je bilo propraćeno i značajnim terapeutskim efektom. Međutim ostao je problem virusne infekcije zgloba, sa neželjenim efektima. Danas se traga za drugim odgovarajućim vektorom.
Pokušalo se i sa proizvodnjom i aplikacijom rastvoljivog IL1/IRAP receptora. Taj receptor (koji je takođe protein) bi se aplikovao intraartikularno, i on bi vezivao za sebe IL1 koji se nalazi u višku u sinovijalnoj tečnosti. Nije došlo do statistički bitnog poboljšanja i smanjenja inflamacije pogođenog zgloba.
Najzad, ACS-IRAP je tretman koji je i kod ljudi i kod životinja dao potpuno zadovoljavajuće rezultate. Kako funkcioniše ovaj sistem? Pošto se već zna za postojanje antagonista IL1, i njihov antagonizam koji je kompetitivne prirode, razmišljalo se kako da se ‘napravi’ IRAP.

IL1 - crvene kuglice koje se vezuju za receptor na površini ćelijske membrane hondrocita ili fibroblasta, izazivajući kaskadnu inflamatornu reakciju i sintezu MMP, agrekanaze i PgE2

Na ideju se došlo, i prvi put je IRAP proizveden, a gde drugo nego u Nemačkoj. Ispostavilo se da monociti iz krvi pacijenta posle kondicioniranja pod određenim uslovima počinju da proizvode velike količine IRAP-a. Ti uslovi su sledeći: krv mora biti uzeta u sterilne epruvete/špriceve koji sadrže kuglice od stakla ili boro-silikata, dijametra 2,5mm, 'presvučene' hrom-sulfatom, koji stimuliše monocite da sintetišu IRAP. Krv pacijenta se izmeša sa kuglicama i stavi u inkubator na 37º u toku 24h (ima podataka da je dovoljno i 6 – 9 sati, ali i onih drugih koji su inkubirali 30 – 36 sati). Koagulacija je sprečena samim kuglicama koje tokom mešanja vezuju za sebe fibrin. Nakon vremena inkubacije epruveta ide u centrifugu, kako bi se serum oslobodio ćelijskih elemenata. Centrifugira se na 5.000rpm (2.900g) tokom 10 minuta. Drugi proizvođači kitova navode 3700-3800rpm (3100g), što verovatno zavisi od veličine epruvete/šprica, odnosno količine krvi koja se uzorkuje. Nakon toga se izdvaja serum bogat IRAP-om, spreman za aplikaciju. U donjoj tabeli dat je spisak svih faktora koji su nađeni u kondicioniranom serumu, koristeći epruvetu od 10ml.

	IRAP	IL6	IL10	FGF-β	VEGF	HGF	IGF1	PDGF AB	TGF-β
Srednja Vrednost	2014,8pg	28,7pg	33,4pg	26,6pg	508,6pg	1339pg	117,2ng	39ng	97,9ng

 

IRAP (plave kuglice) kompetitivno zauzimaju receptore na površini ćelijske membrane hondrocita ili fibroblasta, onemogućavajući IL1 (crvene kuglice) da se veže za receptore i izazove inflamatornu reakciju

Dobra strana ovako dobijenog seruma je ta da se može podeliti u više špriceva i zalediti na -18ºC do -20ºC, i tako čuvati duže vreme. Način lečenja je da se jednom nedeljno u toku nekoliko nedelja daju intraartikularne injekcije kada je u pitanju OA. Obzirom da između IRAP-a i IL1 vlada kompeticija, vrlo je važno da se postigne da u tretiranom zglobu koncentracija IRAP-a bude veća nego IL1. Promena kvantitativnog odnosa IRAP/IL1 u zglobu se postiže tako što se prilikom intraartikularne aplikacije, prvo jednim praznim špricem aspirira koliko je moguće sinovijalne tečnosti koja je bogata u tom trenuntku sa IL1, a tek se onda aplikuje ACS-IRAP. Na taj način se bitno menja odnos između IL1 i IRAP-a u sinovijalnoj tečnosti nekog zgloba u korist IRAP-a, što i jeste preduslov dobrih terapeutskih rezultata. Druga karakteristika ACS-IRAP-a je da se on primenjuje kako u akutnoj fazi, tako i u subakutnoj i hroničnoj, jer proizvodnja IL1 ne prestaje svo vreme, ali je najefikasniji ako se primeni što pre, nakon izbijanja simptoma inflamacije. Tada je najveći efekat, i to uvek treba imati na umu. Zato IRAP i zovu 'prva linija odbrane' kada je OA životinja u pitanju.
Danas već postoje komercijalni kitovi kako za životinje tako i za ljude, mada se solidan ACS-IRAP može dobiti i u dobro opremljenoj laboratoriji.

Različiti kitovi za pripremanje ACS-IRAP

Pored kapsulitisa, sinovitisa i artritisa koji su prvobitno bili tretirani intraartikularnim injekcijama hijaluronata i/ili kortikosteroidima sa malim ili nikakvim poboljšanjem, postoje i druge indikacije za upotrebu ACS-IRAP. Upotrebljava se kod fokalno oštećene hrskavice, a pokazao se dobar i nakon artroskopske intervencije. Malo radova postoji o trertiranju burzitisa i tenosinovitisa ovim produktom, ali tamo gde je rađeno dobijeni su dobri rezultati. Takođe tretman bolnih leđa kod konja sa IRAP-om daje dobre rezultate. Što se pasa tiče, nije se otišlo dalje od tretmana OA, koji je dao dobre rezultate. Problem predstavljaju male rase, kod kojih je problem kolektovati dovoljnu količinu krvi.
U donjoj tabeli dati su podaci za zglobove konja zahvaćenih OA u akutnoj fazi. Nakon inicijalnog tretmana, naredno lečenje sa ACS-IRAP-om moglo bi da se sprovede tek nakon 4-6 meseci od zadnje apliakcije. Postoji razlog za to. U jednom eksperimentu na konjima artroskopski je izazivan OA srednjeg karpalnog zgloba, a zatim je zglob tretiran sa ACS-IRAP. Analizom sinovijalne tečnosti tretiranog zgloba, ali i drugih zglobova koji su bili zdravi i nisu tretirani, izmeren je neobičan porast koncentracije IL1 u sinovijalnim tečnostima svih zglobova. U drugom eksperimentu gde su konji bili lečeni već pomenutom genskom terapijom, došlo se do istog rezultata – sinovijalne tečnosti zdravih i nelečenih zglobova su imali povišene koncentracije IL1. To je naučnike navelo da zaključe da aplikacija IRAP-a stimuliše endogenu sintezu IL1 čak i u zdravim zglobovima. Ona ne počinje odmah, već negde oko 35-og dana od početka tretmana, a povišena koncentracija IL1 može se naći sve do 70-og dana.

Zglob koji se tretira	Količina IRAP-a koja se aplikuje	Interval davanja IRAP-a
Kopitni zglob – distalni interfalangealni zglob	4-6ml	2-3x na 8-14 dana
Proksimalni interfalangealni zglob	2-4ml	2-3x na 8-14 dana
Kičični zglob	4-6ml	2-3x na 8-14 dana
Karpalni zglob (jedna sekcija)	2-4ml	2-3x na 8-14 dana
Lakatni zglob	4-6ml	2-3x na 8-14 dana
Rameni zglob	4-8ml	2-3x na 8-14 dana
Tarzo-metatarzalni zglob	1-2ml	2-3x na 8-14 dana
Skočni zglob	6-8ml	2-3x na 8-14 dana
Koleno (sve tri sekcije)	4-8ml	2-3x na 8-14 dana
Kuk	4-8ml	2-3x na 12-21 dana

Kod ljudi spisak indikacija je mnogo širi. Pored artropatija razne etiologije, ACS-IRAP se koristi vrlo uspešno i kod sportskih povreda mišića, kao i kod kontuzija mekih tkiva. Efikasan je kod skijatičnih i lubarnih bolova, kada se aplikuje perineuralno u sam koren nerva; zatim kod diskopatija koje za posledicu imaju kompresiju nekog nerva, gde se ACS-IRAP može aplkovati i perinerualno i intradiskalno. Kod povreda Ahilove tetive se takođe pokazao kao vrlo efikasan – aplikovan je direktno u tetivu. Tretiraju se još i bol i nestabilnost ramenog zgloba, teniski i golferski lakat, uganuća i nestabilnosti kolena, patelofemoralini sindrom i patelarni tendinitis, uganuća zglobova... Poznat je slučaj jednog od najboljih igrača NBA lige Kobe Briant-a koji je 2011 godine imao povredu levog kolena, koja ga je mogla koštati dalje karijere. Morao je da napravi pauzu, tokom koje je otputovao u Nemačku na lečenje sa ACS-IRAP-om. Pokazalo se da je to bio dobro uložen novac u svoje telo, jer se nakon rekonvalescentnog perioda vratio na parket i dallje igra punom parom.

Kobe Bryant se drži za bolno koleno. Nedugo potom je otišao u Nemačku na lečenje.

Obzirom da je biznis sa ljudskim pacijentima daleko iznad biznisa sa četvoronožnim pacijentima, naučnici su otišli i korak dalje, te su sintetisali rekombinovani, neglikozilovani humani IL1-receptor antagonist. Njegovo komercijalno ime je Kineret®. On se razlikuje od prirodnog IRAP-a po tome što ima jedan metionin više na amino terminusu. Kineret® sadrži 153 aminokiseline, i molekulsku težinu od 17,3 kDa. Za njegovu proizvodnju je korišćena E.Coli bakterija. Njegovo farmakološko svojstvo je isto kao i kod prirodnog IRAP-a – blokira IL1 na mestu aplikacije. Novina je još i ta da je on registrovan i za lečenje pacijenata sa reumatoidnim artritisom, kod kojih nije uspelo lečenje antireumatičnim lekovima. Nema uticaja na karcinogenezu, mutagenezu ili smanjenje feritliteta. Bezbedan je za davanje u trudnoći.
Na kraju terba reći da jedna veterinarska stanica ili ambulanta lako bi mogla kotistiti ACS-IRAP. Potrebno je imati jedan (običan) inkubator, jednu (običnu) centrifugu, kit za kolekciju krvi, i malo znanja kada su u pitanju dijagnostika i intraartikularna aplikacija. Benefiti od korišćenja ovog terapeutskog tretmana su veliki kada su u pitanju psi i konji, a njegove mane...pa recimo da ih za sada nema. Verovatno jedini opravdani razlog je zapravo materijalna situacija u kojoj se nalazimo i mi, i vlasnici životinja sa svojim ljubimcima.

Janko Mrkovački DVM
direktor Stem Art d.o.o.